Năm 1517, chị gái của Margherita, Maria, đã được đính hôn với Federico II Gonzaga, con trai của Francesco II Gonzaga với Isabella d'Este. Tuy nhiên, sau khi Federico tố cáo Maria hạ độc tình nhân Isabella Boschetti của ông, cuộc đính hôn đã bị bãi bỏ.

Cái chết sau này của cha và em trai bà đã thúc đẩy Federico muốn kết hôn Maria để giành quyền cai trị hầu thổ của bà. Nhưng không lâu sau đó, Maria lại qua đời đột ngột vào tháng 9 năm 1530. Do đó Federico chuyển ý sang muốn kết hôn với Margherita. Mẹ bà Anne d'Alençon cũng chấp thuận cuộc hôn nhân.

Karl V, Hoàng đế Thánh chế La Mã muốn Federico kết hôn với Guila xứ Aragon nhưng Nhà Gonzaga đã từ chối.[2]

Sau cái chết của chú bà John George, Margherita trở thành Nữ hầu tước xứ Montferrat.

Cuộc hôn nhân kéo dài được 9 năm cho đến khi Federico mất ở tuổi thứ 40. Với Federico, Margherita có tổng cộng 7 người con:

• Francesco III Gonzaga, Công tước xứ Mantua (1533 - 1550), mất sớm ở tuổi thứ 16.
• Eleonora Gonzaga, sinh và chết yểu năm 1535.
• Anna Gonzaga, sinh và chết yểu năm 1536.
• Isabella Gonzaga (1537-1579). Kết hôn với Francesco Ferdinando d'Ávalos.
• Guglielmo Gonzaga, Công tước xứ Mantua (1538 - 1587). Kết hôn với Nữ Đại Công tước Eleanor của Áo, con gái của Ferdinand I, Hoàng đế Thánh chế La Mã
• Louis Gonzaga, Công tước xứ Nevers (1539 - 1595). Kết hôn với Henriette xứ Cleves,.
• Giáo chủ Federico Gonzaga (1540 - 1565).